DMU vil udsætte de første gensplejsede bakterier i Danmark

- en populær gennemgang af ansøgningen

Indledning
Danmarks Miljøundersøgelser (DMU) har indsendt en ansøgning til Skov- og Naturstyrelsen om tilladelse til at afprøve to gensplejsede bakterier på et forurenet areal ved Hasselager nær Århus. Det sker som led i et EU-projekt der har til formål at udvikle gensplejsede bakterier til at rense jord forurenet med tungtnedbrydelige giftstoffer. I første omgang vil DMU udsætte to prototyper af bakterien Pseudomonas fluorescens for at afprøve hvordan de klarer sig i jord der er forurenet med giftige PCB-forbindelser (PCB=polychlorerede biphenyler). Desuden skal forsøget danne grundlag for en yderligere vurdering af sikkerheden ved at anvende gensplejsede bakterier.

Hvad er formålet med forsøgene ved Hasselager?
Udsætningen sker som led i et EU-forskningsprojekt der sigter på at udvikle teknologien med at bruge bakterier til jordrensning. Forsøgene ved Hasselager skal give svar på følgende specifikke spørgsmål:

• Er podning af bakterierne på planterødder en effektiv måde at tilføre bakterier til forurenet jord?
• Virker bakteriens tilførte nedbrydningsgener så de giver bakterien en overlevelsesfordel i den forurenede jord?
• Virker den gensplejsede bakterie bedre - målt som bakteriens overlevelse og dens nedbrydning af PCB-forbindelser - end eksisterende ikke-gensplejsede bakterier i den forurenede jord?
• Forsvinder bakterierne efter planterne er fjernet fra forsøgsområdet?
• Kan bakterierne sprede sig væk fra forsøgsplanternes rødder?

Hvad er det for to bakterier DMU vil sætte ud?
Der er tale om to bakterier som begge er afledt af Pseudomonas fluorescens F113, en almindelig jordbakterie. Pseudomonas fluorescens F113 blev oprindeligt isoleret fra rødderne af en sukkerroeplante af professor Fergal O’Gara og hans kolleger i Irland.

Arten Pseudomonas fluorescens forekommer almindeligt udbredt overalt i Europa.

Ikke-gensplejsede varianter af arten Pseudomonas fluorescens har i en række tilfælde været brugt i landbruget som biologisk bekæmpelsesmiddel, hvoraf kan nævnes:

• Til bejdsning af radisefrø for at forebygge svampesygdommen Fusarium
• Til at bekæmpe Pythium ultimum og Rhizoctonia solanii ved bejdsning af bomuldsfrø
• Til at bekæmpe Pseudomonas tolaasii i spisesvampe

DMU ønsker at udsætte to gensplejsede stammer af bakterien Pseudomonas fluorescens for at afprøve hvordan de klarer sig i jord der er forurenet med giftige PCB-forbindelser (PCB=polychlorerede biphenyler):

• Pseudomonas fluorescens F113::lacZYrif, der er afledt af F113 ved at tilføre markørgenerne lacZY og selektere en klon der er resistent overfor antibiotikummet rifampicin.
• Pseudomonas fluorescens F113rifpcb, der er afledt af F113 ved at selektere en klon der er resistent overfor rifampicin og tilføre gener for delvis nedbrydning af PCB.

De genetiske ændringer i forhold til F113 er:

• En indsættelse (gensplejsning) af markørgenerne lacZY som stammer fra en kolibakterie, E. coli K12. Disse gener gør at forskerne kan kende bakterien i laboratoriet som blå kolonier på et specielt substrat som indeholder stoffet "X-Gal".
• En indsættelse (gensplejsning) af gener for nedbrydning af stoffet biphenyl, bph, som stammer fra bakterien Burkholderia (tidl. Pseudomonas) cepacia LB400. Disse gener sætter bakterien i stand til at vokse på agarplader med biphenyl som eneste kulstof-kilde. Kolonierne bliver gule når de sprøjtes med test-substratet 2,3-dihydroxy-biphenyl.
• For at gøre det muligt at påvise de gensplejsede bakterier har forskerne selekteret kloner af begge stammer (spontan mutation) der var resistente over for antibiotikummet rifampicin. Rifampicin bruges relativt sjældent af lægerne (primært til behandling af tuberkulose)
• Stamme F113rifpcb indeholder også en kromosomal resistens overfor et ukrudtsmiddel (bialaphos/phosphinothricin).

Pseudomonas fluorescens F113::lacZY har været udsat i EU tidligere (Italien og Spanien), men ikke i forurenet jord.

Pseudomonas fluorescens F113rifpcb kan nedbryde biphenyl til kuldioxid (og vand) og polyklorerede biphenyler til de tilsvarende klorbenzoater og kuldioxid. Klorbenzoaterne forventes at blive optaget af planterne uden at genere disse.

I stamme Pseudomonas fluorescens F113rifpcb udtrykkes bph -generne relativt svagt. Forskerne har planer om at konstruere en stamme hvor nedbrydningen af PCB er optimeret ved en særlig aktivering af disse gener.

Er den gensplejsede bakterie farlig for mennesker?
Pseudomonas fluorescens regnes ikke for farlig hverken for mennesker, dyr eller planter og der er intet i gensplejsningen der skulle ændre ved dette. Pseudomonas fluorescensF113 har sin optimale væksthastighed ved 30 ° C; ved 37 ° C er væksthastigheden kun det halve. Dette viser at stammen ikke er tilpasset vækst i menneskets krop.

I de fleste lande (USA, EU, Canada, Belgien, Australien) er Pseudomonas fluorescens overhovedet ikke klassificeret på listerne over risikoklasser ifm. gensplejsning og arbejdsmiljø. I Tyskland, der er kendt for at have en relativt streng lovgivning på området, optræder arten i den laveste risikoklasse (ingen eller ubetydelig risiko for mennesker og miljø), selv om man er bekendt med enkelte rapporter om forekomst som sekundær infektion i stærkt immun-svækkede patienter.

Det er vigtigt at gøre sig klart at der findes en række forskellige arter inden for slægtenPseudomonas. Den man normalt støder på som problematisk er artenPseudomonas aeruginosa som man fx kan møde i svømmehaller mv. Den er det man kalder opportunistisk patogen.

Den art som DMU søger om at få lov at sætte ud i jorden som led i at udvikle en mikrobiologisk jordrensning hedder Pseudomonas fluorescens . Det er en almindelig bakterie i jord som fx optræder på grøntsager. Den er oprindeligt isoleret fra rødder af sukkerroer.

Hvad skal der ske ved Hasselager?
DMU ønsker at afprøve bakterierne på et 100 kvadratmeter stort areal ved Hasselager, sydvest for Århus. Her er der nemlig en jord som er forurenet med PCB. Forureningen stammer fra et anlæg til skrotning af biler i Hasselager og blev flyttet til det nuværende sted inden for genvindingsindustrien Uniscraps arealer efter at anlægget var nedlagt. Jordens indhold af PCB stammer formodentlig fra bilernes gearkasseolie (i dag er det det for længst forbudt at anvende PCB i gearkasseolie, ligesom loven kræver at olien tappes inden bilerne skrottes).

De gensplejsede bakterier vil blive podet på stiklinger af pil eller på lucernefrø.

Der vil i alt blive anvendt omkring 6,3x10¹¹ bakterier (= 630 milliarder, svarende til ca. 6 gram bakterieceller) af de to bakteriestammer, halvt af hver.

Bakterierne bindes i et fast bæremateriale (pilleringsmasse) og podes på stiklinger og frø i DMU’s laboratorier i Roskilde.

Ved Hasselager plantes stiklingerne af pil (2 pr. kvadratmeter) ud over 30 kvadratmeter, og der sås lucernefrø på andre 30 kvadratmeter. Både stiklingernes rødder og lucernefrøene dækkes straks med jord.

Hvem er DMU’s samarbejdspartnere i projektet?
Udsætningen af gensplejsede bakterier ved Hasselager udføres som led i et EU forskningsprojekt med titlen "Integrated plant/GEM systems for in situ soil bioremediation". Deltagerne i dette projekt er:

• Ulrich Karlson, projektkoordinator og ansvarlig for udsætningen ved Hasselager, Afdeling for Mikrobiel Økologi og Bioteknologi, DMU
• David N. Dowling, Department of Appl. Biol. & Chem., Institute of Technology Carlow, Irland
• Fergal O'Gara, BIOMERIT Research Centre, Microbiology Department, National University of Ireland, Cork, Irland
• Rafael Rivilla, Dept. Biología, Universidad Autónoma, Madrid, Spanien
• Martin Bittens, WCI Umwelttechnik, Wennigsen, Tyskland
• Stephen Francesconi, Nova Research Inc., c/o. Naval Research Laboratory, Washington, D.C., USA.
• Hap Pritchard, U.S. Naval Research Laboratory, Environ. Quality Sciences Sect., Washington, D.C., USA.
• H.C. Pedersen, Afdeling for Frøteknologi, Danisco Seed, Holeby

DMU’s lokale samarbejdspartner i Hasselager er genvindingsindustrien Uniscrap A/S, der har hovedkontor i Åbenrå. Kontaktperson er Mogens Møller-Hansen. Hjemmeside: www.uniscrap.dk

DMU har fået økonomisk støtte til projektet fra:
Miljøstyrelsen, teknologiudviklingsprogrammet for jord- og grundvandsforurening
EU, bioteknologi-programmet, kontrakt nr. BI04-CT97-2227.

Hvad er næste trin i projektet?
DMU og samarbejdspartnerne har i denne sag valgt at gå trinvist frem, således som det også forudsættes i dansk og international lovgivning om udsætning af gensplejsede organismer.

Afhængig af resultaterne planlægger forskerne bag projektet at gennemføre yderligere forsøg med bakteriestammer hvor nedbrydningen af PCB er optimeret ved en særlig aktivering af nedbrydningsgenerne (ved at indsætte en anden såkaldt promotor så bph-nedbrydningsgenerne kan udtrykkes mere effektivt når der er PCB til stede). Med en sådan forøget nedbrydningsaktivitet håber forskerne at opnå en bakterie der er i stand til at rense jorden.

DMU har patentanmeldt teknikken med at tilføre bakterier til forurenet jord ved hjælp af planterødder, men DMU vil ikke selv stå for en eventuel kommerciel udnyttelse af teknikken.

Hvordan kan DMU sikre at bakterierne ikke slipper ud fra Hasselager? Kan man samle de gensplejsede bakterier op igen?
Principielt må man regne med at når en bakterie først er spredt i miljøet kan man ikke trække den tilbage. Men mange forhold taler alligevel for at det vil være muligt at holde de gensplejsede bakterier på forsøgsarealet ved Hasselager og gøre det svært for dem at overleve i længden.

Den ene af de gensplejsede bakterier, Pseudomonas fluorescens F113rifpcb, vil teoretisk set kunne have en vækstfordel i PCB-forurenet jord – i praksis har forskerne ikke kunnet eftervise en sådan vækstfordel. Alle forsøg har vist at de gensplejsede stammer har uændret overlevelse i forhold til den ikke-gensplejsede værtsorganisme Pseudomonas fluorescens F113.

Pseudomonas fluorescens F113 foretrækker at leve på planterødder. Ved at fjerne alle planter fra området reduceres overlevelsen af F113. Herefter kan jord og planter sendes til forbrænding.

De prøver som hentes hjem i laboratoriet vil blive autoklaveret når de er analyseret.

Hvorfor har man gensplejset bakterierne? Kunne man ikke bare bruge de naturlige?
I en række tilfælde har det vist sig at man kan bruge naturligt forekommende bakterier til at rense jord. I tilfældet med PCB har man hidtil ikke kunnet finde bakterier i naturen der kan rense jorden inden for en overkommelig tid.

Derfor har forskerne i EU-projektet grebet til at forene evnen til at vokse på planterødder med evnen til at nedbryde PCB i håb om at denne kombination vil kunne føre til en effektiv rensning af jorden.

Hvordan kan man finde bakterierne i naturen?
Begge de gensplejsede bakterier er mærket på forskellig vis så forskerne kan følge hvordan de trives efter udsætningen ved Hasselager.

Den vigtigste teknik vil være dyrkning på agarplader med rifampicin. Endvidere kan identiteten af kolonierne tjekkes ved en række egenskaber ved de to bakterier, så forskerne altid kan vide om de står med den ene eller den anden.

Hvad sker der med bakterierne når forsøget er slut?
DMU vil følge de gensplejsede bakteriers skæbne i op til syv år. Herefter afsluttes forsøget ved at høste planterne i området, aflive dem med et passende bekæmpelsesmiddel og evt. fjerne og afbrænde jorden, alt efter resultaterne af forsøgene og myndighedernes bestemmelser.

Hvilke erfaringer har man/DMU med at bruge bakterier til at rense jord? Er bakterierne et nyt mirakelmiddel?
Forskerne i DMU’s Afdeling for Mikrobiel Økologi og Bioteknologi har studeret mulighederne for at udnytte bakterier til at spise forurening i en årrække. Nogle af de tidlige erfaringer er beskrevet i TEMArapport fra DMU nr. 4/1996, "Forureningsbekæmpelse med mikroorganismer". Et eksempel på et senere arbejde er beskrevet i DMUNyt nr. 98/4 i artiklen "Planter og bakterier går sammen om at rense jorden". Begge kan ses på DMU’s hjemmeside.

Biologisk rensning er ikke et mirakelmiddel, men kan i en række tilfælde være et fornuftigt og økonomisk alternativ til andre metoder til rensning af jord. I Danmark er der registreret næsten 3.000 kemikalieforurende grunde og mange af dem er til fare både for miljøet og for sundheden. Det er derfor vigtigt at udvikle effektive og miljøvenlige metoder til at rense jorden og grundvandet.

Inden for de seneste 5-10 år har man verden over forsket i at anvende bakterier og svampe til at fjerne forureninger i miljøet. Den såkaldte bioremediering anses som et miljøvenligt alternativ til traditionelle rensningsmetoder, som fx ventilering, ekstraktion og forbrænding af forurenet jord.

Hvordan behandles/afgøres ansøgningen?
For at få lov at sætte de gensplejsede bakterier ud i naturen skal man i Danmark søge myndighederne om en tilladelse. DMU har sendt ansøgningen til Skov- og Naturstyrelsen som bl.a. sender et resumé af ansøgningen i høring til miljømyndighederne i de øvrige EU-lande. Den endelige afgørelse ligger hos Miljøminister Svend Auken. Det vil i givet fald være første gang der bliver udsat gensplejsede bakterier i Danmark.

Inden for EU er der til dato anmeldt 47 forsøgsudsætninger med gensplejsede bakterier, heraf 15 med Pseudomonas fluorescens. Til sammenligning er der anmeldt over 1.500 forsøgsudsætninger med gensplejsede planter, heraf 34 i Danmark.

Seniorforsker Ulrich Karlson eller
Forskiningschef Niels Kroer
Afdeling for Miljøkemi og Mikrobiologi
Danmarks Miljøundersøgelser
Frederiksborgvej 399, Postboks 358
Roskilde
Tlf. 4630 1200